Отчёт за 2014 год

Требования технического задания по I этапу исследований выполнены в полном объеме. За отчетный период было проведено 11 экспериментов на животных, в т.ч. 6 на модели крыс Wistar, 2 на модели крупного рогатого скота (Bos Taurus), 1 на кроликах (Oryctolagus cuniculus), 2 на курах (Gallus gallus). По итогам исследований подготовлено 10 статей, из которых 5 – опубликовано в изданиях, индексируемых в базе данных РИНЦ, одна опубликована, 2 статьи приняты для публикации в изданиях, индексируемых в базе данных «Сеть науки» (Web of Science), и одна статья находится на рецензировании, 1 — принята для публикации в издании, индексируемом в базе данных «Scopus». Подготовлена и подана одна заявка на защиту результатов интеллектуальной деятельности.

По п.1 технического задания – регламент поиска выполнен полностью.

В процессе проведения патентных исследований было просмотрено по классам G01N33/48 — 97 источников; А61В5/00– 114 источников; А23К1/00 – 78 источника; А61В6/00 – 131 источников; А61К33/00 – 115 источников; A01K67/00 – 91 источников; А23К1/16– 112 источника;  А23К1/175 – 127 источников; G01N33/84 – 101 источник, из которых для анализа было отобрано 49 документов, и ранжированы по на-правлениям поиска: способ оценки элементного статуса животных – 13 источников, способ лечения и профилактики элементозов — 9; способ повышения продуктивности животных – 5; способ выявления наночастиц металлов в тканях животных – 2; препараты с микроэлементами на основе наночастиц металлов – 13; корм с использованием микро-, наночастиц металлов для животных – 7. При анализе результатов патентных исследований обнаружено, что внедрением разработок по данной тематике занимаются 28 рубежных и   российских компаний.

По итогам выполнения НИР и на основании анализа патентных документов предложены новые технические решения в области создания способа отбора шерсти для изучения элементного статуса животных, способа оценки изменений в элемент-ном статусе животных по различным участкам волос, способа повышения продуктивности животных,  способа коррекции элементозов животных,  способа выявления наночастиц металлов в тканях.

По п.2 технического задания проведен анализ более чем 1 тыс. литературных источников, что позволило сформировать общие представления о проблеме, проанализировать реализованные пути ее решения. Дана оценка современного состояния технологий неинвазивной оценки и коррекции элементозов в персонализированной медицине и животноводстве. Намечены пути решения задач по проекту, сформирован комплекс современных методов и подходов, обеспечивающих достижение желаемой цели – разработку новой технологии оценки элементного статуса, выявления и коррекции элементозов сельскохозяйственных животных.

По п. 3 технического задания разработаны методики, при этом использованы принципы и подходы, изложенные исполнителями в МУК 4.1.1482-03; МУК 4.1.1483-03 и защищенные патентами RU 2230491; 2302640; 2478956 и др.

Анализ биообразцов проводился с помощью единой взаимосвязанной аналитической системы, объединяющей методы ИСП-АЭС и ИСП-МС. Для определения Al, As, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Se, Si, Sn, Ti, V использовался масс-спектрометр Elan 9000 (Perkin Elmer, США), определение Ca, Mg, P, Zn, K, Na проводилось на атомно-эмиссионном спектрометре Optima 2000 V (Perkin Elmer, США). Техническая компетенция подтверждена аккредитацией РОСС RU. 0001.22ПЯ.05.

Эксперименты на животных осуществляли в соответствии с требованиями Женевской конвенции и по разрешению этического комитета Оренбургского государственного университета (протокол № 12 от 15.07.2014).

По п. 4. технического задания в т.ч.: «исследования по формированию базы данных, обобщающие показатели концентраций и обменного пула…» проведен один эксперимент на кроликах (Oryctolagus cuniculus) и два эксперимента на крысах Wis-tar. В ходе исследований сформирована база данных показателей концентраций и пула 25 химических элементов в тканях тела животных при различной нутриентной обеспеченности в т.ч. при минералдефицитной диете и др. Подтверждена информативность элементного состава шерсти при индивидуальной оценке величин пула токсичных элементов в организме — Al, Cd, Hg, Pb, Sr. Прогнозирование общего пула эссенциальных и условно-эссенциальных микроэлементов (МЭ) в организме по составу шерсти возможно в донозологический период. При этом элементный состав шерсти животных согласовано изменялся с размером пула этих веществ в организме по 11 элементам. Выявлено увеличение концентраций в шерсти Zn, Mn, Si, V на фоне уменьшения общего пула в организме. При дизадаптации, сопровождающейся нарушением гомеостатических механизмов и изменением состава крови, элементный состав шерсти менее информативен. В частности, при оценке пула Zn выявлено, что по мере снижения его концентрации в теле кроликов (в качестве адекватного уровня использованы данные для клинически здоровых животных при содержании на стандартном рационе) на 17-25 % имеет место повышение концентрации этого элемента в шерсти на 31-53 %, в то время как дальнейшее снижение размера пула Zn на 40-45 % сопряжено со снижением концентрации элемента в шерсти на 51-65 %.

Результаты экспериментальных исследований

В эксперименте на кроликах (Oryctolagus cuniculus, m=1600-1650 г., возраст 3 мес., n=90, длительность учетного периода 30 суток) моделировались различные уровни дефицита минеральных веществ в кормлении, через использование полусинтетических рационов. Изменения в составе рациона сопровождались достоверным снижением пула макроэлементов Ca, K Mg, P в организме опытных кроликов в I опытной группе в 2,1; 1,4; 1,5; 1,9 раза, во II группе в 2,7 на 5,7 %; 1,3; 1,8 раза соответственно. В эксперименте отмечалось последовательное снижение содержания в крови макроэлементов, достигших статистически значимых отличий к концу исследований по калию в I и II группах, по Mg и P в I опытной группе. Динамика содержания этих элементов свидетельствовала об истощении депо. Информативность элементного состава шерсти при оценке пула макроэлементов подтверждена для Ca, K, Mg.

Анализ пулов эссенциальных и условно-эссенциальных МЭ, содержание их в отдельных органах и тканях кроликов, в связи с концентрацией в шерсти, выявил согласованную динамику по Cr, Cu, Co, As, B, I, V. В тоже время по Zn, Mn, Fe, Si, V изменение значений было разнонаправленным. По отдельным элементам описаны случаи не согласованного изменения пула и концентрации элементов в шерсти в опытных группах.

I эксперимент на крысах был выполнен на двух группах (m=200-210 г, n=60) двухмесячных крысах-самцах Wistar и включал два последовательных периода: первый – уравнительный (две недели) и учетный (восемь недель). Животные контрольной группы в учетный период получали сбалансированный полусинтетический рацион, составленный с учетом рекомендаций О.Л. Обольского (2001). Опытной группе скармливали такой же рацион, но без минерального премикса. Фактическое содержание оцениваемых элементов в опытном рационе было ниже в 10-150 раз в сравнении с контролем.

По окончанию эксперимента общий пул 23-х химических элементов в теле животных опытной группы достоверно снизился в сравнении с контролем. Пул кальция и калия уменьшился в 2,2 и 1,9 раза, микроэлементов Se, Cr, Mn, Cu в 2,6; 2,5; 2,0 и 1,8 раза, соответственно и т.д.. В то же время в крови лабораторных животных значимых отклонений в содержании химических элементов между группами выявлено не было. В печени достоверно снизилась концентрация натрия на 28,2 (P<0,05), селена — 63,4 % (P<0,01), а содержание меди и цинка увеличилось на 41,7 и 9,9 % (P<0,05), соответственно. В условиях эксперимента элементный состав шерсти животных согласовано изменялся с размером пула этих веществ в организме по 13 элементам. В то же время по ряду элементов выявлен факт роста их концентраций в шерсти на фоне уменьшения общего пула. Так, уровень Р в шерсти животных опытной группы достоверно превышал аналогичный показатель в контроле на 38%, Cr — 45,8, As — 66,7, Ni — 87 % (Р<0,01). Этот факт объясняется тем, что ответная реакция организма на гипоэлементоз выражается извлечением химических элементов из депо, что и приводит к большему их отложению в шерсти. Аналогичное действие описано исполнителями ранее для антагонистов, в частности, у человека в паре «Zn-Cu» при алкоголизме.

Методика проведения II эксперимента (самцы Wistar, m= 220-240 г, возраст 2 мес., n=51, длительность учетного периода 60 сут.) предполагала изменение пула эссенциальных и условно-эссенциальных химических элементов в организме животных через изменение уровня не крахмальных полисахаридов. В условиях эксперимента элементный состав шерсти животных согласовано изменялся с размером пула этих веществ в организме по 11 элементам. Выявлено увеличение  концентраций в шерсти Zn, Mn, Si (в 1,2 – 4,4 раза) на фоне уменьшения общего пула в организме.

По п.4 технического задания «разработка методики взятия образцов биосубстратов животных» на модели 120 голов крупного рогатого скота исследованы образ-цы шерсти (затылочной части головы, проекции первого хвостового позвонка, в проекции медианны 12-го ребра, в области подгрудка, холки и кисти хвоста) по элемент-ному составу (25 показателей); по соответствию независимых выборок (состава) од-ной совокупности; скорости отрастания; по степень загрязненности; соотношение и элементный состав компонентов шерсти (остевые волосы, пух и др.).

Отбор проб проводился у животных в пастбищный (август) и стойловый период (октябрь), проба по месту взятия формировалась как средняя с 3-5 точек с участка 5×5 см. Загрязненность шерсти устанавливалась путем последовательного взвешивания образцов нативной шерсти до и после процедуры очистки, включающей замачивание в течение трех часов в дистиллированной воде (t=50-600 С), ультразвуковой об-работки (35 кГц), и последующим использованием моющих сред: бидистиллированной воды — раствора этилового спирта (40%) — бидистиллированной воды.

На основании обобщения всего материала было сделано заключение о целесообразности отбора проб с холки. Этот вывод основывается на следующих результатах. По степени загрязненности пробы с холки и подгрудка содержали наименьшее количество примесей: 8,14±1,02; 9,01±0,73 % в стойловый период и 4,80±0,83; 5,42±0,71% в пастбищный период по массе соответственно.

Суммарное загрязнение для других четырех мест было достоверно большим, с максимальными значениями для кисти хвоста, составившие 84,3±8,65% в стойловый и 28,8±3,21% в пастбищный период.

Целесообразность выбора участка для сбора образцов шерсти обусловлена неодинаковым элементным составом этого биосубстрата, собранного с различных мест. Как следует из полученных данных, расхождения в элементном составе шерсти, собранной с различных мест, определялись неодинаковой скоростью роста различных компонентов шерсти. Выявили, что наибольшая скорость роста характерна для остевых волос с холки 0,38±0,033 мм/сут, что достоверно на 79% (Р<0,001) превосходит аналогичные показатели для подгрудка, на 29% (Р<0,001) для ости с области проекции I хвостового позвонка. Достоверно интенсивнее (0,22±0,02 мм/сут) растут пуховые волокна на поверхности кожи первого хвостового позвонка. Элементный состав пуховых и остевых волокон также был различным. Это определяет большую объективность методики отбора средних проб с участка тела крупного рогатого скота почти лишенного пуховых волокон – холки. В тоже время формирование элементного состава шерсти крупного рогатого скота на различных участках тела происходит по одним и тем же законам. Этот вывод подтверждается верностью пошаговой проверки гипотезы, согласно которой средние значения двух выборок относятся к одной и той же совокупности. Целесообразность отбора проб шерсти для элементного анализа с холки определяется и более высокой скоростью роста остевых волос, что важно в практической работе.

Согласно разработанной методике взятия образцов шерсти КРС средняя проба шерсти (4-5 г) формируется путем объединения образцов, собранных с 3-5 мест холки,  скорректированных по длине, соответствующей отрастанию в оцениваемый период времени с учетом скорости роста волос — 0,38 мм/сут.

Обработка баз данных элементного состава клинически здоровых животных позволила рассчитать предварительные значения 25 и 75 центилей концентрации химических элементов в шерсти крупного рогатого скота возраста 18-60 месяцев. Эти значения следующие: Al (15.4; 38,49); As (0,0491; 0,083); B (2,51; 8,69); Ca (1886; 3150); Cd (0,0177; 0,0343); Co (0,0629; 0,126); Cr (0,056; 0,159); Cu (3,9; 5,52); Fe (21,19; 41); Hg (0,0041; 0,01); I (0,37; 0.707); K (437; 691); Li (0,275; 0,62); Mg (380; 749); Mn (14,82; 35,94); Na ( 275; 451); Ni (0,405; 0,851); P (96,01; 213); Pb (0,412; 0,0447); Se (0,323; 0,823); Si (8,21; 31,31); Sn (0,0117; 0,0447); Sr (11,53; 22,7); V (0,102; 0,263), Zn (81.59; 99,16). Введение допущения, по которому значения, лежащие в интервалах 0-25 и 75-100 центилей условно принимаются как «дефицит» и «избыток» рассматриваемого вещества (например, Ca1 и Ca4, Са 2/3 — «норма»), позволило для случаев, при которых коэффициент корреляции между Ca и Mg превысил 0,94, сформировать группы (63,8% наблюдений), описываемые уравнением с показателями качества большими 93,5% (набор условий — Al4+As4+Be4+Cd4+Co4+Cr4+Cu1+Cu4+Fe4+I1+K4+Li4+Mg4+P4+ Si4+Sn4+Zn4).

Однако, ввиду малой выборки (n<200) полученные значения центильных интервалов на следующем этапе исследований необходимо уточнить, что является обязательным условием для наиболее точной диагностики элементозов.

По п.4 технического задания «разработка способа отбора шерсти животных для изучения элементного статуса», подана заявка № 2014145406 на получение патента РФ на изобретение.

По п.4 технического задания «исследования биологических эффектов на фоне введения наночастиц металлов — микроэлементов в организм животных с целью последующей разработки технологии коррекции элементозов» выполнено две серии экспериментов. В рамках I серии дана оценка биодоступности различных форм железа и меди — наночастиц, их агломератов и микрочастиц, с целью разработки наиболее эффективных препаратов для коррекции элементозов.

Исследование биологической активности наночастиц, агломератов наночастиц и микрочастиц железа и меди проводилось в тесте ингибирования бактериальной биолюминесценции in vitro. В качестве объекта воздействия использован генноинженерный люминесцирующий штамм Echerichia coli K12 TG1, конститутивно экспрессирующий  luxCDABE-гены природного морского микроорганизма Photobacterium leiongnathi 54D10, производство НВО «Иммунотех» (Россия, Москва). Из результатов теста ингибирования бактериальной биолюминесценции следовало, что по мере уменьшения размера частиц наблюдалось увеличение их биологической активности, о чем свидетельствовало нарастание подавления свечения тест-культуры.

Исследования in vivo были проведены на цыплятах-бройлерах, которым по достижению 14 дневного возраста в рамках отдельных групп однократно в/м (в бедро) вводили наночастицы (80±5 нм), агломераты наночастиц (924±29,6 нм) и микрочастицы (10±0,4 мкм) железа в дозе 2 мг/кг массы животного. Анализ данных показал достоверное увеличение прироста живой массы, содержания общего белка в крови и аргинина в печени птицы во всех опытных группах. Наночастицы являлись наиболее реакционноспособными из всех исследуемых частиц в отношении живого организма: после введения наночастиц железа показатели прироста живой массы, содержание общего белка в крови и аргинина в печени опытной группы (прил.8) превышали контрольные значения на 6,7 (р≤0,01), 2,51 (р≤0,01) и 2,25 (р≤0,05) % соответственно. Введение агломератов наночастиц железа и микрочастиц железа приводило к более низким показателям или к отсутствию каких-либо изменений за тот же промежуток времени.

В эксперименте на модели крыс Wistar показаны различия в  динамике поступления железа в кровь при внутримышечном однократном введении лиозолей наночастиц железа (d=80±5 нм) и агломератов наночастиц железа  (d=418±17,1 нм) в дозировке 2,0 мг/кг массы животных. Пролонгированность элиминации железа из депо (прил.5), созданного внутримышечными инъекциями, позволяет рассматривать препараты агломератов наночастиц железа в качестве источника микроэлемента при лечении элементозов.

Во второй серии исследований дана оценка биологических эффектов многократных инъекций препаратов наночастиц металлов-МЭ на организм животным. В первом эксперименте описаны морфофункциональные изменения тканей в местах введения и обмен химических элементов (25 показателей) многократных внутримышечных инъекциях (1 раз в неделю на протяжении 7 недель) препаратов агломератов наночастиц Fe (d=431±13,8 нм). Внутримышечное введение агломератов наночастиц Fe формирует депо этого элемента, обнаруживаемое в течении более чем 21 суток в миосимпластах мест инъекций, отмечено увеличение железа в макрофагах, в том числе локализуемых в соединительной ткани, окружающей триады печени. Оценка готовности клеток к апоптозу в печени, селезенке, почках выявила экспрессию антитела каспазы-3 только в селезенке (до 2.9±0.06‰).  Концентрация Fe в совокупности скелетной мускулатуры (без учёта места инъекции) снижается. Внутримышечные инъекции агломератов наночастиц Fe негативно отражаются на обмене целого ряда химических элементов.

В эксперименте дана оценка элементного статуса тканей экспериментальных животных (крысы-самцы линии Wistar) при многократном (1 раз в неделю на протяжении 12 недель) внутримышечном введении наночастиц Cu типа Cu10x в дозе 2,0 мг/кг массы животного. Установлено, что при введении наночастиц Cu в биотических дозах (до 4 мг/кг) не происходят критических изменений концентрации общего пула элементов. Дальнейшее увеличение нагрузки наночастицами Cu на организм вызывает дисбаланс МЭ в печени и селезенке и увеличение экспрессии каспазы-3 в печени до 1,5 ‰ и в селезенке до 8,3 ‰. Установлен зобогенный эффект наночастиц Cu на фоне депрессии обмена йода. Это проявлялось пролиферацией тироцитов, преобладанием мелких, лишенных коллоида фолликул, увеличением количества митозов среди тироцитов в 1,6 раза, увеличением числа клеток, экспрессирующих Ki – 67 с 5,4±0,2 ‰ до 12,6±0,3 %.

2015 год

 

По пункту 1 технического задания «Экспедиционное обследование различных подвидов Bos Taurus с использованием вновь разработанной методики отбора биосубстратов» проведено экспедиционное обследование различных подвидов Bos Taurus (герефордская, абердин-ангусская, симментальская породы крупного рогатого скота) с использованием вновь разработанной методики отбора биосубстратов (Miroshnikov S., et.al. 2015). В ходе обследования собраны и проанализированы биосубстраты 891 животного. Осуществлено 11 экспедиционных командировок по территории Оренбургской, Челябинской и Курганской областей РФ. Элементный состав шерсти исследовали по 25 показателям (Al, As, Be, Cd, Hg, Li, Ni, Pb, Sn, Ti, V, I, Ca, Co, Cr, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na, P, Se, Si, Zn). Использовали методы атомно-эмиссионной и масс-спектрометрии (АЭС-ИСП и МС-ИСП) на оборудовании Elan 9000 (Perkin Elmer, США) и Optima 2000 V (Perkin Elmer, США). Экспедиционные обследования выявили наличие специфических внутривидовых различий в элементном статусе животных. В частности это показано на примере клинически здоровых коров герефордской и казахской белоголовой пород первого отёла, содержащихся в условиях одного сельскохозяйственного предприятия при сходных рационах кормления. Элементный состав шерсти животных находился в тесной связи с гендерными и возрастными особенностями сравниваемых микропопуляций, видом продуктивности животных. Анализ данных, полученных для симментальской породы, выявил, что направление продуктивности тесно связано с элементным составом шерсти животных. Коровы молочного направления продуктивности данной породы достоверно отличались от мясных по содержанию в шерсти Ca на 29,6 %; Al – на 128,0; Cd – на 58,3; Mn – на 48,6; Ni – 120; Zn – на 29,3 % и уступали по накоплению I на 27,5 %; K – на 46,8; Na– на 46,1; B– на 33,0 и Hg– на 53 %. Сформированные при экспедиционных обследованиях данные были использованы при нахождении референтных и центильных величин.

По пункту 2 технического задания «Исследования по формированию базы данных мультиэлементного состава отдельных биосубстратов животных» проведено две серии экспериментов. В первой выполнено два исследования на кроликах Oryctolagus cuniculus (I и III эксперимент) и один на крысах Wistar (II эксперимент), продолжительностью 28, 63 и 56 суток, соответственно. Исследовано содержание химических элементов в отдельных органах и тканях животных в связи с пулом этих веществ в организме. В рамках I и III экспериментов животные I группы получали сбалансированный рацион, II группы   дефицитный по минералам рацион (прил. 30). Живая масса кроликов в начале эксперимента составила в I группе 1616,4±85,4 г, во II группе 1602,8±47,6 г, в конце эксперимента 1923,1±105,6 г в  I группе, 1583,1±50,3 г во II группе. Живая масса крыс 111,9±2,7 г в I, и 115±2,5 г во II группе, в конце эксперимента 255,8±3,2 г в I и 292,0±4,1 г во II группе. В ходе исследований описаны изменения по содержанию в организме животных химических элементов. На момент окончания эксперимента в организме кроликов II группы в сравнении с I группой содержалось достоверно меньше цинка на 48,4% (Р<0.01), кальция на 65,5% (Р<0.01), магния на 53% (Р<0.05), фосфора в 1,87 раза (Р<0.01), калия на 40,4% (Р<0.05), стронция на 71% (Р<0.001), но больше ванадия на 86% (Р<0.01), алюминия в 2 раза (Р<0.001). В исследованиях на крысах не выявлен не один факт большего пула химических элементов в организме животных II группы в сравнении с I группой.  Оценка различий по совокупному содержанию химических элементов в скелете кроликов выявила идентичность с общим пулом химических элементов в организме. В эксперименте на крысах выявлен факт увеличения содержания в скелете животных II группы в сравнении с I группой стронция на 22,1% (Р<0.001), селена на 32,5% (Р<0.001). В печени крыс II группы значительно увеличилось содержание 14 из 20 рассматриваемых элементов. Наиболее значительно свинец в 4 раза (Р<0.001), алюминия в 2,3 раза (Р<0.001), кобальта на 62,5% (Р<0.01), и т.д.

Исследования выявили большее содержание в отросшей за период опыта шерсти кроликов II группы хрома в 6,85 раза (Р<0.001), железа в 4,1 раза (Р<0.001), марганца в 2,2 раза (Р<0.01), никеля в 5,2 раза (Р<0.001), ванадия в 5,9 раза (Р<0.01), алюминия в 6,3 раза (Р<0.01), свинца в 3,9 раза (Р<0.01)  в сравнении с  I группой.

В I группе кроликов выявило наличие только шести элементов, концентрация которых в шерсти достоверно коррелировала с размером пула элемента в организме. В том числе ванадий (r=0,78), йод (r=0,88), кобальт (r=-0,85), фосфор (r=0,80), алюминий (r=0,89) и марганец (r=-0,71). Во II группе кроликов из 20 оцениваемых элементов по 15 ( As, Co, Cr, Cu, Fe, I, K, Mg, Na, P, Pb, Se, Sr, V, Zn) выявлена достоверная корреляционная связь  между   составом шерсти и размером пула элемента в организме кроликов. Рассмотрение связи состава шерсти с размерами отдельных пулов химических элементов во внутренних органах, желудочно-кишечном тракте, мышцах, скелете, крови, кожи так же подтвердили факт нарастания числа достоверных корреляционных связей на фоне несбалансированного кормления. Причем наибольшее число корреляций отмечалось во II группе при сравнении состава шерсти и кожи по 14 элементам (Al, As, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, K, Mn, Ni, Pb, Sr, V, Zn).

В эксперименте на крысах была подтверждена зависимость числа корреляционных связей состава шерсти с пулом элементов в организме животных от сбалансированности минерального питания. Во II группе крыс из 20 оцениваемых элементов по 13 (Ca, Cd, Cr, Cu, Fe, Mg, Mn, Ni, Pb, Se, Sr, V, Zn) выявлена достоверная корреляционная связь между составом шерсти и размером пула элемента в организме кроликов.

Это в целом согласуется с результатами исследований (Chojnacka et al., 2010). Однако наряду со снижением концентрации в шерсти ряда элементов, при их дефиците в рационе, мы фиксировали факт увеличения концентрации в шерсти химических элементов (Ca, Mg, Na, P  и др.) при снижении их пула в организме. Например, в I эксперименте на кроликах размер совокупного пула кальция в организме животных II группы снизился до 14,5±1,33 г. При этом содержание этого элемента в шерсти выросло на 27,9% в сравнении с I группой.  Ранее, аналогичные результаты были получены (Оберлис Д. и др.., 2008).  Объяснение этого факта, возможно, на основе явления гомеостаза. Закономерно, что поддержание постоянства внутренней среды организма при дефиците кальция в пище, возможно через извлечение этого элемента из «депо». В I эксперименте нами показано снижение содержания кальция в скелете кроликов II группы на 64,3% (Р<0.001). При этом масса  кальция увеличилась во внутренних органах на 28,8% (Р<0.01),  в  крови животных  на 33,3% (Р<0.001) в сравнении с I группой (на рисунке 3 представлено аналогичное изменение концентрации в печени животных II группы подавляющего числа элементов у крыс). Таким образом, изменения в обмене кальция и были описаны составом шерсти.

В этой связи достоверное снижение концентрации кальция в шерсти крыс II группы (II эксперимент) на 45,3% (Р<0.01)   в сравнении с I группой, можно объяснить исчерпанием «депо» кальция. По нашим данным пул кальция в организме крыс II группы к концу эксперимента снизился в 2,7 раза. Аналогичное снижение в I эксперименте составило только 64 % .

Методика III эксперимента на модели Oryctolagus cuniculus была идентична I эксперименту, с тем отличием, что убоев животных было сделано пять. Целью эксперимента являлось изучение динамики содержания в шерсти кальция и ряда других элементов в связи с их пулом в организме. Рассмотрен переход от нормы к преддефициту и дефициту элементов.

Во второй серии экспериментов проведена оценка соразмерности содержания в шерсти животных (крысы Wistar) химических элементов и их пула в организме в связи с условиями питания. В первом эксперименте формировали пищевой стресс при добавлении в основной рацион продуктов быстрого приготовления (ПБП) в сочетании с газированными напитками. Длительное потребление ПБП, в том числе и в сочетании с газированными напитками, способствовало достоверному увеличению содержания: Ca, Mg, P, K, Na, Cu, Fe и снижению Zn, Mn, Se. Установлено, что в условиях эксперимента элементный состав шерсти животных согласовано изменялся с размером пула большинства этих веществ в мышечной ткани. Выявлено увеличение концентраций в шерсти P, K, Na, Fe и Co (в 1,1 – 8,7 раза) на фоне повышения Ca, Zn, Mn (в 1,3 – 1,4 раза) — на фоне уменьшения общего пула в мышечной ткани.

Во втором эксперименте этой серии дана оценка информативности шерсти при оценке хронической интоксикации организма этанолом и кадмием. Продолжительность эксперимента составила 45 суток. Животные опытной группы на фоне потребления 15% раствора этанола содержались на стандартном рационе с добавлением CdSO4 (23,55 мг/кг/сут). В эксперименте выявлен факт поражения ряда систем организма (прил.36) и развитие элементозов на фоне интоксикационной нагрузки, что проявилось снижением содержания в крови Mg, P, As, Fe, Cu, Si, Zn и увеличением концентрации Cd. При изучении элементного состава шерсти лабораторных животных, подвергшихся воздействию нескольких ксенобиотиков, были выявлены достоверные различия по K, As, Co, Cr, Fe, Ni, Zn, Cd, Pb (прил.38).

По пункту 3 технического задания «Разработка способа оценки изменений в элементном статусе животных по различным участкам волос» проведены исследования и подготовлена заявка на получение патента РФ на изобретение. Изобретение относится к сельскому хозяйству, защищает приоритет создания способа исследования элементного статуса крупного рогатого скота в различные возрастные периоды по длине шерсти. Поставленная цель достигается путем настрига шерсти с верхней части холки животного с участка кожи площадью 5х5 см² и вычислением дистального отрастания, соответствующего периоду роста в изучаемый временной интервал. Сущность предлагаемого способа заключается в том, что вычисление дистального отрастания осуществляется путем произведения скорости отрастания шерсти за сутки на количество суток в изучаемом периоде по формуле: L = S×I, где L – дистальное отрастание шерсти, отмеряемое от корня, мм; S – скорость роста шерсти, мм/сут. I — изучаемый возрастной интервал времени, сут. С целью подтверждения гипотезы о неоднородности элементного состава различных участков по длине шерсти было проведено исследование на шерсти, отобранной с верхней части холки крупного рогатого скота мясного направления продуктивности (n=60 гол.) за стойловый и пастбищный периоды. При выполнении гранта в первый год установлено, что скорость отрастания шерсти на холке животного составляет 0,375±0,033 мм/сут. Продолжительность изучаемых периодов в нашем случае составила по 58 суток. Подставив значения в приведенную нами формулу получили дистальное отрастание шерсти стойловому и пастбищному периодам роста: L =0,375мм/сут × 58суток = 21,75мм ≈ 2,2 см. В зависимости от полученных результатов отобранные образцы по длине шерсти разделили на два участка: первый участок – 2,2 см от корня, соответствующий стойловому периоду, второй участок – выше 2,2 см, соответствует пастбищному периоду содержания. Основными кормами для животных при содержании в стойловый период служили сено житняковое, сенаж из суданской травы и концентраты, в пастбищный период — злаковое разнотравье. Результаты исследований показали неоднородность химического состава по длине шерсти в зависимости от периодов содержания по ряду химических элементов: B, Ca, Cd, Cr, Li, Mg, Mn, Pb, Se, Sr. Для выявления отклонений концентрации химических элементов по длине шерсти животных, сформированной в разные временные периоды, была произведена оценка полученных данных с учетом стандартных значений центильных шкал. В результате установлено, что в участке шерсти по длине, сформированном в пастбищный период, имело место отклонение от значений, принятых за норму по 10 из 25 изучаемых элементов, против 2 в стойловый период. Формула изобретения: Способ исследования элементного статуса крупного рогатого скота в различные возрастные периоды путем определения уровня содержания химических элементов в шерсти с верхней части холки животного, отличающийся тем, что для химического анализа, пробы шерсти формируются с участка кожи площадью 5х5 см² и оцениваются по концентрации содержания элементов по дистальному расстоянию шерсти за изучаемый возрастной период с учетом скорости отрастания от корня шерсти по вышеприведенной формуле.

По пункту 4 технического задания «Определение референтных и центильных величин концентраций химических элементов в шерсти Bos Taurus»  впервые, определены референтные величины концентраций химических элементов в шерсти Bos Taurus: Al  1,86-786,0, m=131,1; As 0,02-0,38,  m=0,1; B 0,40-22,11, m=4,967; Ca 237-5718, m=2332,8; Cd  0,00-0,17, m=0,03; Co 0,01-0,67, m=0,17; Cr 0,00-1,90, m=0,3; Cu 1,94-8,94, m=5,4; Fe 5,43-747,00, m=144,7; Hg  0,00-0,15, m=0,01; I 0,07-14,71, m=0,72; K 99,22-9353 , m=1803,2; Li 0,08-3,77, m=0,622; Mg 102-1656, m=622,889; Mn 1,69-134,00, m=30,439; Na 94,23-6096,00, m=1266,7;  Ni 0,08-2,51; m=0,694; P 96,01-609,00, m=216,83; Pb 0,05-1,39, m=0,324; Se 0,02-2,37; m=0,491; Si 0,05-227,00, m=25,57; Sn 0,00-0,17, m=0,02; Sr 1,29-35,56, m=15,05; V 0,02-1,97, m=0,459; Zn 52,92-628,00, m=116,08 (здесь и далее концентрация элементов в шерсти даны как мкг/г).

Впервые, определены значения «физиологической нормы» для Bos Taurus (величины 25 и 75  центиля  концентраций химических элементов в шерсти):Al  29,62-171; As 0,079-0,19; B 2,23-6,74; Ca1625-2998; Cd  0,016-0,038;Co 0,071-0,235; Cr 0,129-0,461; Cu 4,61-6,23; Fe 36,65-207; Hg  0,002-0,01;I  0,313-0,893; K 638-2735; Li 0,218-0,779; Mg 409-798; Mn 16,64-36,88; Na 328-916;  Ni 0,426-0,859; P 160-254; Pb 0,179-0,417; Se 0,201-0,781;  Si 8,07-31,54; Sn 0,01-0,02; Sr 9,94-18,96; V 0,151-0,662; Zn 94,86-124.

Значимость для науки вновь полученных данных подтверждается успехами учение об элементозах человека и числом обращений в медицинские центры, использующих новых подходы к диагностике и коррекции элементозов (http://en.microelements.ru/).

Проведенные экспедиционные обследования территорий выявили специфические отличия в значениях среднестатистических и центильных интервалов для вида Bos Taurus, что ранее описано нами для биогеохимических провинций проживания человека (Скальный, Мирошников и др., 2014). Установлено, что у 36,2% животных разводимых на территории Оренбургской области в шерсти отмечено превышение значения 75 центиля Курганской по ртути, 75,9 по олову и 51,7% по кадмию. Животные Оренбургской области характеризовались более высокими значениями 25 и 75 центильных величин. Эти значения были выше аналогичных показателей Курганской популяции соответственно по хрому на 203,3 и 103,0%, железу — 43,8 и 56,9, йоду- 57,7 и 75,7, селену — 73,2 и 142%, алюминию – 147,1 и 63,5, мышьяку — 26,7 и 37,9, кадмию — 57,1 и 34,5, ртути — 25,0 и 22,2, олову — 133,3 и 215,8. Более низкими по фосфору на 60,8 и 83,3 %, магнию на 110,0 и 42,4, кальцию на 57,1 и 18,1, бору – 295,6 и 225,9, литию – 68,9 и 97,4, стронцию на 72,8 и 28,4%.

Обработка полученных данных позволила предложить новый «Способ диагностики элементозов молодняка крупного рогатого скота по элементному составу шерсти». По материалам подготовлена и подана заявка на получение патента РФ на изобретение.

Способ включает определение уровня содержания химических элементов в шерсти и оценку результатов с учетом стандартных значений центильных шкал. При значении концентрации химических элементов от 10 до 90 центильного значения уровень оценивают как нормальный, значения, лежащие в интервале от 0,1 до 10 и от 90 до 99,9 центиля, оценивают как отклонения, соответствующие состоянию предболезни. В качестве диагностической биосреды была использована шерсть, отобранная от молодняка крупного рогатого скота мясного и молочного направлений продуктивности. Для подтверждения вывода о взаимосвязи между показателями здоровья обследованных животных и уровнем содержания в их организме химических элементов были проведены исследования состояние общей реактивности организма методом интегральных коэффициентов (клеточно-фагоцитарной защиты (КФЗ), специфического иммунного лимфоцитарно-моноцитарного потенциала (СИЛМП)) показателей периферической крови, бактерицидную активность сыворотки крови (БАСК), концентрацию бета-лизинов и лизоцимов. Для наблюдений были сформированы три группы практически здоровых животных по 30 голов в каждой: контрольная группа – показатели химического состава шерсти находились в интервале от 10 до 90 центиля; I группа – от 0,1 до 10 центиля; II группа – от 90 до 99,9 центиля. Результаты оценок приведены в приложениях 27,28.

Формула изобретения: Способ диагностики элементозов молодняка крупного рогатого скота по элементному составу шерсти, включающий определение концентрации химических элементов и оценку результатов по распределению значений в границах центильных шкал, при значениях в интервале от 10 до 90 центильного уровня оценивают, как нормальные, от 0,1 до 10 и от 90 до 99,9 центиля включительно оценивают, как отклонения, соответствующие состоянию предболезни.

По пункту 5 технического задания «Разработка новых подходов к использованию наноматериалов для коррекции элементного статуса животных» проведено две серии исследований. В рамках первой была дана детальная оценка действия ультрадисперсных препаратов микроэлементов на организм цыплят-бройлеров, изучено токсическое действие препаратов.  Разработана и проверена гипотеза формирования ответа организма птицы на поступление из вне ультрадисперсных элементарных металлов, запускаемого взаимодействием частиц препарата с макрофагами и последующей активизацией синтеза аргинина. Экспериментальное подтверждение разработанной гипотезы позволило разработать принципиально новые решения по созданию препаратов микроэлементов. Установлен факт повышения живой массы бройлеров при использовании в рационе наночастиц железа (80±5 нм) совместно с комплексом аминокислот «аргинин+лизин+метионин». Исследования выполнены на 300 цыплятах-бройлерах, которых методом аналогов разделили на 10 групп (n=30). В начале эксперимента в возрасте 15 суток птице II, III и IV групп производились внутримышечные (в/м) инъекции лиозолей наночастиц железа в дозе 2 мг/кг живой массы. Повторная инъекция наночастиц производилась через 2 недели. Опытной птице V,VI и VII групп наночастицы вносились в основной рацион (ОР) ежедневно в дозе 4 мг/кг корма. Методика исследований предполагала дополнительное скармливание аминокислот во IV, V, VI, VIII, IX, X. Введение в основной рацион дополнительных количеств аминокислот без сочетания с наночастицами железа сопровождалось увеличением прироста цыплят-бройлеров в VIII, IX и X относительно контроля. Использование наночастиц железа в составе основного рациона VII группы в качестве микроэлементной добавки приводило к значимому приросту живой массы только на 8 сутки исследования. Совместное использование наночастиц железа с аргинином цыплятам сопровождалось аналогичным повышением интенсивности роста. Наиболее значительный эффект был получен при комбинации всех факторов. Скармливание цыплятам-бройлерам препарата наночастиц железа совместно с аргинином, метионином и лизином сопровождается повышением коэффициентов переваримости протеина и углеводов на 6,7 и 5,19 %. При этом эффективность конверсии протеина и энергии корма увеличивается на 7,5 и 2,8 %. В ходе выполнения гранта впервые дана сравнительная оценка физиологического и продуктивного действия внутримышечного и энтерального путей ввода наночастиц железа в организм птицы. Скармливание препарата наночастиц железа в отличии от внутримышечного введения не сопровождается достоверным повышением в крови содержания иммунокомпетентных клеток, СОЭ. В то же время независимо от пути введения препарата наночастиц железа концентрация в крови цыплят гемоглобина и эритроцитов достоверно повышается в течение первой недели. Прием наночастиц железа per os не сопровождался изменениями концентрации общего белка в сыворотке крови через сутки. В эксперименте подтверждена гипотеза активизации образования оксида азота при поступлении наночастиц железа. Анализ аминокислотного состава печени показал достоверное изменение содержания аргинина в печени птицы в группах, получающих наночастицы железа per os и  в/м  и отсутствие этого эффекта в других группах. Сочетание внутримышечных инъекций наночастиц с добавлением аргинина в корм сопровождалось ростом пула  в организме Ca и Mg на 1,89 и 2,38% (Р≤0.01). Использование комплекса «аргинин+лизин+метионин» в рационе совместно с инъекцией наночастиц железа в IV группе увеличивает содержание Ca, Mg и P в сравнении с контролем на 3,84 (Р≤0.001), 2,05 и 3,81% (Р≤0.01). Аналогичное влияние оказывает внесение наночастиц железа в корм без внесения аминокислот в VII группе, что приводит к увеличению значений Ca, Mg и P на 3,73 (Р≤0.01), 3,23 и 2,91% (Р≤0.01). Внесение аргинина совместно с наночастицами железа сопряжено с ростом пулов Ca, Mg и P на 4,07 (Р≤0.001), 2,38 и 3,24 % (Р≤0.01). Помимо макроэлементов в V, VI и VII группах наблюдалось увеличение содержания железа на 3,12 5,7 и 4,88 % (Р≤0.01) (прил.13,14).

В рамках работ по практической апробации наночастиц металлов и их соединений в качестве препаратов-микроэлементов проведен сравнительный анализ чувствительности четырех коммерчески доступных и лабораторных люминесцирующих штаммов бактерий к воздействию 10 наночастиц (Cu диаметр 50–110 нм;  MgO  25–75 нм; Cr2O3 60–170 нм;  Fe2O3 80–150 нм;  CuO 30–110 нм и др.) В тесте ингибирования бактериальной биолюминесценции, биосенсоры на основе природного морского изолята Photobacterium phosphoreum и рекомбинантных штаммов Escherichia coli, варьируя по величинам минимальных токсических концентраций и значениям ЕС50, давали согласованную оценку биотоксичности наиболее активных соединений, по степени ее убывания ранжируемых в ряду Cu > (MgO, CuO) . Вновь сконструированный биосенсор на основе Bacillus subtilis (штамм EG 168-1) продемонстрировал наибольшую чувствительность к НЧ, существенно расширив спектр наночастиц и наноматериалов, при воздействии на интенсивность бактериальной биолюминесценции проявляющих себя как токсичные.

По итогам второй серии исследований была подготовлена и подана на рассмотрение заявка на получение патента РФ на изобретение (способ повышения продуктивности и формирования депо эссенциальных элементов в теле цыплят-бройлеров). Исследования in vivo были проведены на цыплятах-бройлерах «Смена-7».  В 14 дневном возрасте однократно внутримышечно (в бедро) цыплятам вводили: I группе – стерильный физраствор 200 мкл/гол.;  II – препарат микрочастиц меди размером 40±0,5 мкм в дозе 2 мг/кг живой массы. Разовая инъекция микрочастиц сопровождалась повышением интенсивности роста птицы только на 14 сутки на 8,13 % (Р≤0.01), через 17 суток на 8,76 % (Р≤0.01) и к окончанию исследований на 6,22 % (Р≤0.01). Значения общего белка характеризовались ростом показателей спустя сутки после инъекций в опытной группе на 1,67 (Р≤0.05) %, через 7 суток после введения на 16,7 (Р≤0.01) (прил.15). Количество меди в крови птицы характеризовалось ростом показателей в опытной группе на 2,03 % через 7 суток, на 7,97 % (Р≤0.001) через 21 сутки после введения частиц, по сравнению с контрольной группой. Введение микрочастиц меди приводило к росту количества эритроцитов. Отмечен рост размера пулов в организме цыплят-бройлеров целого ряда химических элементов. На основании исследований была предложена формула изобретения: способ повышения продуктивности и депо эссенциальных элементов в теле цыплят-бройлеров при внутримышечном введении высокодисперсных частиц меди, включающий в 14-дневном возрасте внутримышечное введение в бедро препарата микроэлемента меди размером 40±0,5 мкм в дозе 2 мг/кг массы птицы.

При выполнении исследований на крысах-самцах линии Wistar методом пар-аналогов было сформировано две группы животных (n=50). Животным опытной группы 1 раз в неделю на протяжении 7 недель вводили в бедренную группу мышц препарат наночастиц железа (80±5 нм, Z-потенциал 15±0,2 мВ, 2,0 мг/кг массы животного). Животным контрольной группы вводили – стерильный физраствор 200 мкл/гол. Изучение динамики показателя общего минерального состава тканей экспериментальных животных, проведенное в течение 49 сут. свидетельствует о наличии значительных изменений в обмене целого ряда химических элементов (прил.19, 20, 21, 22). Качественная гистохимическая реакция Перлса в печени дает положительной результат только на 14 сутки после 1 инъекции. На протяжении эксперимента при первой инъекции микроструктура печени на световом уровне не нарушена. Однако, при исследовании динамики трансаминаз (АсАТ, АлАТ) выявлено изменение их активности (прил.23, 24). Рост активности АсТ характеризуют действие наночастиц, как цитотоксическое. Многократное введение препарата приводило к увеличению концентрации токсических элементов Pb на 25,0%, Cd на 40%, Al на 17,4%. На их фоне происходит уменьшение концентрации микроэлементов.

 

   2016 год

 

Этап I.

1. В процессе выполнения НИР регламент патентных исследований выполнен полностью. Подготовлен патентный отчет, основанный на анализе около 900 источников по классам G01N33/48; А61В5/00; А23К1/00; А61В6/00; А61К33/00; A01K67/00; А23К1/16; А23К1/175; G01N33/84, из которых для дальнейшей работы было отобрано 49 документов.
2. Представлен аналитический обзор и анализ современной научно-технической, нормативной, методической литературы (более 1 тысячи источников), что позволило сформировать общие представления о проблеме, проанализировать реализованные пути ее решения. Дана оценка современного состояния технологий неинвазивной оценки и коррекции элементозов в персонализированной медицине и животноводстве.
3. Разработаны методики, основанные на принципах и подходах, изложенных исполнителями в МУК 4.1.1482-03; МУК 4.1.1483-03 и защищенные патентами RU 2230491; 2302640; 2478956 и др. Обосновано использование единой взаимосвязанной аналитической системы, объединяющей методы ИСП-АЭС и ИСП-МС для исследований элементного состава биосубстратов.
4. По итогам экспериментов на модели Oryctolagus cuniculus сформированы базы данных показателей концентраций и пула двадцати пяти химических элементов в тканях тела животных (шерсть, мышечная ткань, костная ткань, печень, ж.к.т. и др.) при различной нутриентной обеспеченности в т.ч. при минералдефицитной диете и др. в двух экспериментах на модели крыс Wistar. Подтверждена информативность элементного состава шерсти при индивидуальной оценке величин пула токсичных элементов в организме — Al, Cd, Hg, Pb, Sr. Прогнозирование общего пула эссенциальных и условно-эссенциальных микроэлементов (МЭ) в организме по составу шерсти, возможно, в донозологический период. При этом элементный состав шерсти животных согласовано изменялся с размером пула этих веществ в организме по 11 элементам. Выявлено увеличение концентраций в шерсти Zn, Mn, Si на фоне уменьшения общего пула в организме. При дизадаптации, сопровождающейся нарушением гомеостатических механизмов и изменением состава крови, элементный состав шерсти менее информативен.
5. На основании результатов исследований на модели 120 животных (крупный рогатый скот) сформированы базы данных и разработана методика взятия образцов биосубстратов животных для изучения элементного статуса. Согласно разработанной методике взятия образцов шерсти крупного рогатого скота средняя проба шерсти (4-5 г) формируется путем объединения образцов, собранных с 3-5 мест холки, скорректированных по длине, соответствующей отрастанию в оцениваемый период времени с учетом скорости роста волос — 0,38 мм/сут.

Базы данных включают: содержание 25 элементов; соответствие независимых выборок (состава) одной совокупности; скорость отрастания; степень загрязненности; соотношение и элементный состав компонентов шерсти (остевые волосы, пух и др.) с затылочной части головы, проекции первого хвостового позвонка, в проекции медианны 12-го ребра, в области подгрудка, холки, кисти хвоста. На основании обобщения всего материала было сделано заключение о целесообразности отбора проб с холки. Этот вывод основывается на следующих результатах.

По степени загрязненности – наименьшее содержание примесей наблюдалось в пробах шерсти с холки и подгрудка: 8,14±1,02; 9,01±0,73 % в стойловый период и 4,80±0,83; 5,42±0,71% в пастбищный период по массе соответственно. Суммарное загрязнение для других четырех мест было достоверно большим, с максимальными значениями для кисти хвоста, составивших 84,3±8,65% в стойловый и 28,8±3,21% в пастбищный период.

Целесообразность выбора участка тела для сбора образцов шерсти обусловлена неодинаковым элементным составом и скоростью роста этого биосубстрата, собранного с различных мест. Выявлено, что наибольшая скорость роста характерна для остевых волос с холки 0,38±0,033 мм/сут, что достоверно на 79% (Р<0,001) превосходит аналогичные показатели для подгрудка, на 29% (Р<0,001) для ости с области проекции I хвостового позвонка. Достоверно интенсивнее (0,221±0,02 мм/сут) растут пуховые волокна на поверхности кожи первого хвостового позвонка. Элементный состав пуховых и остевых волокон также различен. Это определяет большую объективность методики отбора средних проб с участка тела крупного рогатого скота почти лишенного пуховых волокон – холки. В тоже время формирование элементного состава шерсти крупного рогатого скота на различных участках тела происходит по одним и тем же законам.

6. По итогам исследований разработан способ отбора шерсти животных для изучения элементного статуса, (заявка № 2014145406 на получение патента РФ на изобретение).
7. Исследованы биологические эффекты на фоне введения наночастиц металлов — микроэлементов в организм животных (экспериментальные данные).

В рамках работ по разработке препаратов-микроэлементов проведены исследования и сформированы базы данных параметров обмена веществ и морфофункциональных характеристик организма цыплят-бройлеров при использовании разноразмерных фракций элементарного Fe и Cu. В эксперименте на модели цыплят-бройлеров показано, что однократные внутримышечные инъекции наночастиц Fe (80±5 нм) в отличие от агломератов наночастиц (924±29,6 нм) и микрочастиц (10±0,1 мнм) этого элемента сопровождающиеся повышением интенсивности роста на 6-10%.

Кроме этого база данных включает характеристики морфологического и биохимического состава крови, аминокислотный состав печени и др. биосубстратов и др.

В эксперименте на модели крыс Wistar показаны различия в динамике поступления железа в кровь при внутримышечном однократном введении лиозолей наночастиц железа (d=80±5 нм) и агломератов наночастиц железа (d=418±17,1 нм) в дозировке 2,0 мг/кг массы животных. Пролонгированность элиминации железа из депо, созданного внутримышечными инъекциями, позволяет рассматривать препараты агломератов наночастиц железа в качестве источника микроэлемента при лечении элементозов.

Во второй серии исследований дана оценка биологических эффектов многократных инъекций препаратов наночастиц металлов-микроэлементов на организм животных. В первом эксперименте описаны морфофункциональные изменения тканей в местах введения и обмен химических элементов (25 показателей) многократных внутримышечных инъекциях (1 раз в неделю на протяжении 7 недель) препаратов агломератов наночастиц Fe (d=431±13,8 нм). Внутримышечное введение агломератов наночастиц Fe формирует депо этого элемента, обнаруживаемое в течении более чем 21 сутки в миосимпластах мест инъекций, отмечено увеличение железа в макрофагах, в том числе локализуемых в соединительной ткани, окружающей триады печени. Оценка готовности клеток к апоптозу в печени, селезенке, почках выявила экспрессию антитела каспазы-3 только в селезенке (до 2.9±0.06‰).  Концентрация Fe в совокупности скелетной мускулатуры (без учёта места инъекции) снижается. Внутримышечные инъекции агломератов наночастиц Fe негативно отражаются на обмене целого ряда химических элементов.

В эксперименте сформирована база данных элементного статуса тканей экспериментальных животных (крысы-самцы линии Wistar) при многократном (1 раз в неделю на протяжении 12 недель) внутримышечном введении наночастиц Cu типа Cu10x в дозе 2,0 мг/кг массы животного. Увеличение нагрузки наночастицами Cu более 4 мг/кг вызывает дисбаланс МЭ в печени и селезенке и увеличение экспрессии каспазы-3 в печени до 1,5% и  в селезенке до 8,3 ‰. Установлен зобогенный эффект наночастиц Cu на фоне депрессии обмена йода. Это проявлялось пролиферацией тироцитов, преобладанием мелких, лишенных коллоида фолликул, увеличением количества митозов среди тироцитов в 1,6 раза, увеличением числа клеток, экспрессирующих Ki – 67 с 5,4±0,2% до 12,6±0,3%.

8. Подготовлена и подана одна заявка на защиту результатов интеллектуальной деятельности.

Этап II.

1. В ходе 11 командировок по территории Оренбургской, Челябинской и Курганской областей РФ, проведено экспедиционное обследование различных подвидов Bos Taurus (герефордская, абердин-ангусская, симментальская породы крупного рогатого скота) и создана база данных, включающая результаты исследований элементного состава (25 показателей) биосубстратов (шерсть, мышечная ткань и др.) более 1 тыс. животных. Сформированные при экспедиционных обследованиях данные были использованы при нахождении референтных и центильных величин. Экспедиционные обследования выявили наличие специфических внутривидовых различий в элементном статусе животных. Элементный состав шерсти животных находился в тесной связи с гендерными и возрастными особенностями сравниваемых микропопуляций, видом продуктивности животных. Анализ данных, полученных для симментальской породы, выявил, что направление продуктивности тесно связано с элементным составом шерсти животных. Коровы молочного направления продуктивности данной породы достоверно отличались от мясных по содержанию в шерсти Ca на 29,6 %; Al – на 128,0; Cd – на 58,3; Mn – на 48,6; Ni – 120,0; Zn – на 29,3 % и уступали по накоплению I на 27,5 %; K – на 46,8; Na– на 46,1; B– на 33,0 и Hg– на 53,0 %
2. Проведены две серии исследований по формированию базы данных мультиэлементного состава отдельных биосубстратов животных. В первой выполнено два эксперимента на кроликах Oryctolagus cuniculus и один на крысах Wistar. Сформирована база данных содержания химических элементов (25 показателей) в отдельных органах и тканях животных в связи с пулом этих веществ в организме с учетом скармливания сбалансированных или дефицитных по минералам рационов.

Исследования выявили большее содержание в отросшей за период опыта шерсти кроликов при дефицитном рационе хрома, железа, марганца, никеля, ванадия, алюминия, свинца. В группе кроликов, получавших сбалансированный рацион, выявлено наличие только шести элементов, концентрация которых в шерсти достоверно коррелировала с размером пула элемента в организме. Рассмотрение связи состава шерсти с размерами отдельных пулов химических элементов во внутренних органах, желудочно-кишечном тракте, мышцах, скелете, крови, кожи так же подтвердили факт нарастания числа достоверных корреляционных связей на фоне несбалансированного кормления. Причем наибольшее число корреляций отмечалось при сравнении состава шерсти и кожи по 14 элементам (Al, As, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, K, Mn, Ni, Pb, Sr, V, Zn).

В эксперименте с более длительным, но менее выраженным гепоэлементозом выявлено 13 элементов (Ca, Cd, Cr, Cu, Fe, Mg, Mn, Ni, Pb, Se, Sr, V, Zn)  по содержанию которых в шерсти возможно оценить размер пула элемента в организме кроликов.

Во второй серии экспериментов проведена оценка соразмерности содержания в шерсти животных (крысы Wistar) химических элементов и их пула в организме в связи с условиями питания. Показано, что элементный состав шерсти животных согласовано изменялся с размером пула большинства этих веществ в мышечной ткани.

Во втором эксперименте этой серии дана оценка информативности шерсти при оценке хронической интоксикации организма этанолом и кадмием. Элементный состав шерсти лабораторных животных оказался информативен при оценке обмена K, As, Co, Cr, Fe, Ni, Zn, Cd, Pb.

3. Проведены исследования и подготовлена заявка на получение патента РФ на изобретение, с целью защиты приоритетности «Способа оценки изменений в элементном статусе животных по различным участкам волос».

Скорость отрастания шерсти на различных участках тела крупного рогатого скота установлена исполнителями в первый год выполнения гранта.

Экспериментальная проверка способа, для пастбищного и стойлового содержания животных, подтвердила верность предложенного алгоритма.

4. Впервые, определены референтные величины концентраций химических элементов в шерсти Bos Taurus. : Al 1,86-786,0, m=131,1; As 0,02-0,38,  m=0,1; B 0,40-22,11, m=4,967; Ca 237-5718, m=2332,8; Cd  0,00-0,17, m=0,03; Co 0,01-0,67, m=0,17; Cr 0,00-1,90, m=0,3; Cu 1,94-8,94, m=5,4; Fe 5,43-747,00, m=144,7; Hg  0,00-0,15, m=0,01; I 0,07-14,71, m=0,72; K 99,22-9353 , m=1803,2; Li 0,08-3,77, m=0,622; Mg 102-1656, m=622,889; Mn 1,69-134,00, m=30,439; Na 94,23-6096,00, m=1266,7;  Ni 0,08-2,51; m=0,694; P 96,01-609,00, m=216,83; Pb 0,05-1,39, m=0,324; Se 0,02-2,37; m=0,491; Si 0,05-227,00, m=25,57; Sn 0,00-0,17, m=0,02; Sr 1,29-35,56, m=15,05; V 0,02-1,97, m=0,459; Zn 52,92-628,00, m=116,08. (здесь и далее концентрация элементов в шерсти даны как мкг/г).

Впервые, определены значения «физиологической нормы» для Bos Taurus (величины 25 и 75  центиля  концентраций химических элементов в шерсти): Al  29,62-171; As 0,079-0,19; B 2,23-6,74; Ca1625-2998; Cd  0,016-0,038;Co 0,071-0,235; Cr 0,129-0,461; Cu 4,61-6,23; Fe 36,65-207; Hg  0,002-0,01;I  0,313-0,893; K 638-2735; Li 0,218-0,779; Mg 409-798; Mn 16,64-36,88; Na 328-916;  Ni 0,426-0,859; P 160-254; Pb 0,179-0,417; Se 0,201-0,781;  Si 8,07-31,54; Sn 0,01-0,02; Sr 9,94-18,96; V 0,151-0,662; Zn 94,86-124.

Значимость для науки вновь полученных данных подтверждается успехами учения об элементозах человека и числом обращений в медицинские центры, использующих новых подходы к диагностике и коррекции элементозов (http://en.microelements.ru/).

Проведенные экспедиционные обследования территорий выявили специфические отличия в значениях среднестатистических и центильных интервалов для вида Bos Taurus.

Обработка полученных данных позволила предложить новый «Способ диагностики элементозов молодняка крупного рогатого скота по элементному составу шерсти». По материалам подготовлена и подана заявка на получение патента РФ на изобретение.

5. На основании результатов проведенных исследований предложен способ создания искусственных депо эссенциальных элементов в организме сельскохозяйственных животных, что достигается через внутримышечные инъекции стерильных взвесей микрочастиц металлов-микроэлементов (Fe, Cu) d= 10-40 мкм. Формируемое депо элемента характеризуется отдаленными эффектами на продуктивность, что для цыплят-бройлеров реализуется через 2-3 недели.

Разработаны принципиально новые решения по созданию препаратов микроэлементов. Установлен факт повышения живой массы и конверсии корма в продукцию цыплят-бройлеров при использовании наночастиц железа совместно с комплексом аминокислот «аргинин+лизин+метионин».

В ходе выполнения гранта впервые дана сравнительная оценка физиологического и продуктивного действия внутримышечного и энтерального путей ввода наночастиц железа в организм птицы.

В рамках работ по практической апробации наночастиц металлов и их соединений в качестве препаратов-микроэлементов проведен сравнительный анализ чувствительности четырех люминесцирующих бактерий к воздействию 10 наночастиц (Cu диаметр 50–110 нм; MgO  25–75 нм; Cr2O3 60–170 нм;  Fe2O3 80–150 нм;  CuO 30–110 нм и др.). В тесте ингибирования бактериальной биолюминесценции биосенсоры, на основе природного морского изолята Photobacterium phosphoreum и рекомбинантных штаммов Escherichia coli, дана оценка биотоксичности веществ, ранжируемых в ряду Cu > (MgO, CuO).

При выполнении исследований на крысах-самцах Wistar изучена динамика показателя общего минерального состава тканей экспериментальных животных при многократных инъекциях (еженедельно в течение 49 суток) наночастиц железа (80±5 нм). Выявлены значительные изменения в обмене целого ряда химических элементов. Многократное введение препарата приводило к увеличению концентрации токсических элементов Pb, Cd, Al. На их фоне происходит уменьшение концентрации микроэлементов.

По материалам исследований второго этапа подготовлена и подана заявка на получение патента РФ на изобретение. Формула изобретения: способ повышения продуктивности и величины депо эссенциальных элементов в теле цыплят-бройлеров при внутримышечном введении высокодисперсных частиц меди, включающий в 14-дневном возрасте внутримышечное введение в бедро препарата микроэлемента меди размером 40±0,5 мкм в дозе 2 мг/кг массы птицы.

По итогам исследований II этапа подготовлено и опубликовано 21 статья, из них 13 в изданиях, индексируемых в базе данных Scopus и Web of Science. Подано три заявки на получение патентов РФ на изобретения.

Этап III.

За 2016 год полностью выполнены все запланированные работы. Проведено 4 экспедиционных поездки по сбору биоматериала, выполнено 11 экспериментов на животных, в т.ч. 1 на модели крыс Wistar, 6 на модели крупного рогатого скота (Bos Taurus), 4 на курах (Gallus gallus).

1. Методика выявления, коррекции и профилактики элементозов продуктивных животных Bos Taurus включает основные положения:

Выявление элементозов. В качестве субстрата для оценки элементного статуса используется шерсть животных. Отбор проб шерсти животного производится с холки по предлагаемой методике, с датированием периода оценки элементного статуса по длине шерсти с учетом скорости её отрастания.

Исследования элементного состава шерсти производятся методами, обеспечивающими точность измерения 10-9-10-12г, в том числе масс-спектрометрическим и атомно-эмиссионным методами по отдельным элементам с обязательным использованием стандартных образцов.

Полученные данные сопоставляются со значениями 25 и 75 центиля концентраций в шерсти животных химических элементов для отдельных половозрастных групп разводимых на данной территории.

Превышение значений 90 центиля символизирует состояние гиперэлементоза для эссенциалных элементов (существуют исключения). Значения концентрации менее 10 центиля соответствует состоянию гипоэлементоза. (Примечание: методика не может быть эффективно использована для случаев выраженной патологии обмена веществ).

Коррекция. На основании сопоставления концентраций в шерсти химических элементов и физиологических норм принимается решение о реализации комплекса мер по коррекции рационов животных.

Для эссеницильных элементов при концентрациях меньших значения 10 центиля (состояние гипоэлементоза) принимается решение о дополнительном введении в рацион лимитированных элементов.

Для эссенцильных элементов (Ca и др.) значения больше 90 центиля рассматриваются как состояние преддефицита и также корректируются дополнительным включением в рацион их источников.

В случае превышения значений нормы по содержанию в шерсти животных токсических элементов (Al, As, Cd, Hg, Pb, Sn) на фоне гипоэлементоза по эссенциальным элементам первоначальные мероприятия по коррекции должны предусматривать выведения избытка токсических веществ из организма с последующей коррекцией рационов по эссенциальным элементам. Случаи превышения норм в парах эссенциальных элементов антагонистов (например Cu-Zn) с обязательным превышением 90 центиля для одного элемента и при значениях ниже 10 центиля для другого, первоначальные мероприятия коррекции должны устранить избыток одного из веществ.

Расчет дозировок дополнительно вводимых при коррекции сорбентов, химических элементов определяются нормами питания скорректированными с учетом размерности обменного пула в организме.

Контроль эффективности мер по коррекции производится путем повторной оценки состава шерсти.

Профилактика элементозов основывается на выше описанных принципах и формируется на основе ранее установленных индивидуальных и групповых характеристиках элементного статуса.

База данных по апробации новой методики включает результаты шести экспериментов на крупном рогатом скоте. Использование методики позволило повысить воспроизводительную способность потомков импортированного скота; скорректировать бардасодержащие рационы и предложить для откорма минеральный премикс с включением кальция, йода, бора, хрома; оптимизировать элементный статус и снизить падеж телят; выявить интоксикацию тяжёлыми металлами и повысить воспроизводительную способность дойных коров.

2. Математическая модель формировалась на основе построения обобщенной функции вектора состояния , оценивающей элементный состав шерсти животных с учетом межэлементных взаимодействий. При исследовании учитывалось отклонение среднего показателя содержания изучаемых элементов в пробах шерсти животного от усредненного показателя химического состава проб шерсти, которое наиболее соответствует общему элементному статусу организма животного.

Исследования проводились на базе аналитической платформы Deductor Studio Аcademic. В результате удалось отразить обобщенный показатель, (интервал 0-25 центиля), как:  = 0.0515-0.0575*Al+0.066*As+0.0516*B+0.0233*Ca-0.0646*Cd+0.1278*Co-0.0332*Cr-0.0204*Cu-0.0659*Fe-0.0036Hg+0.1243*K-0.1549*Li+0.0171*Mg+0.1048*Mn +0.0322*Na+0.0522*Ni-0.0547*P+0.0575*Pb+0.1754*Se+0.0307*Si-5.804E(-04)*Sn+ +0.1061*Sr-0.0728*V-0.0108*Zn (при уровне значимости   и степени свободы 24). Индекс детерминации показывает, что значение обобщенного показателя на 74% зависит от изменения содержания микроэлементов в шерсти животного.

Для интервала 25-75 центиля:  =19.3248+0.122*Al+0.0007*As+0.0671*B-0.2954*Ca-0.0619*Cd+0.2441*Co-  0.0805*Cr-0.0029*Cu-0.1123*Fe+0,0856*Hg+0.0877*K-0.1076*Li-0.0709*Mg+0.27*Mn +0.419*Na-0.0322*Ni-0.1403*P-0.0505*Pb-0.0029*Se+0.0606*Si+0.0377*Sn+0.2729*Sr-0.2597*V-0.0667*Zn (при уровне значимости   и степени свободы 24). Индекс детерминации показывает, что значение обобщенного показателя на 48% зависит от изменения содержания микроэлементов в организме животного.

Для интервала 75-100 центиля: =53.4692+0.1533*Al+0.0361*As+0.0725*B+0.1148*Ca-0.0159*Cd+0.111*Co-0.347*Cr+0.0399*Cu+0.3707*Fe+0.0105*Hg-0.0276*K-0.0873*Li+0.0459*Mg++0.1714*Mn +0.1428*Na+0.116*Ni+0.0934*P-0.2222*Pb+ 0.057*Se-0.0389*Si++0.0979*Sn-0.0676*Sr-0.3178*V-0.024*Zn  при уровне значимости

α=0.005 и степени свободы 24. Полученный индекс детерминации показывает, что значение обобщенного показателя на 72% зависит от изменения содержания элементов в организме животного.

Разработанные алгоритмы предсказательного моделирования оценки пулов химических элементов в организме продуктивных животных перспективны для предиктивной аналитики биоэлементного статуса организма животных.

3. База данных обобщающая результаты исследований на модели цыплят-бройлеров кросса «Смена 8». Показано, что НЧ Fe в сравнении с сульфатом железа в рационе молодняка птицы способствуют повышению переваримости питательных веществ корма после 2-3 недель применения. Птица, получавшая НЧ Fe более эффективно трансформирует корм в продукцию.

Сочетанное использование НЧ Fe с аргинином (креатином) обеспечивает повышение интенсивности роста цыплят-бройлеров на 7,1-8,4%, при повышении переваримости органического вещества корма на 2,0-2,3 %, сырого протеина на 3,5-4,0%. Отмечен факт снижения содержания жира в теле бройлеров на 2-5% при скармливании НЧ Fe аргинина (или креатина). При этом достигается эффект оптимизации уровня аргинина в печени, отмечаемый при поступлении НЧ Fe без добавок.

База данных включает результаты исследований по влиянию наночастиц –потенциальных препаратов микроэлементов на этологические показатели животных с описанием нейротропного действия.

На основании анализа структурно-функционального состояния коры головного мозга крыс, поведенческих реакций животных и элементного состава коры головного мозг, установлен нейротоксический эффект наночастиц при введении внутрибрюшинно, степень и характер которого менялся в зависимости от дозы и времени, прошедшего после инъекции. Обнаружены патоморфологические изменения в моторной и соматосенсорной зонах коры мозга крыс, возникшие вследствие нарушения процессов кровообращения. Установлены выраженные изменения элементного гомеостаза коры головного мозга крыс опытных групп. Выявленные структурные изменения сопровождались повышением ориентировочно-исследовательской, двигательной активности и эмоционального состояния животных с большей степенью выраженности при введении железа в дозе 14 мг/кг. К концу эксперимента процессы возбуждения преобладали над процессами торможения, что привело к угнетению деятельности центральной нервной системы опытных животных на фоне адаптации к стрессу в контрольной группе.

4. Корм для птицы, включает комплекс наночастиц Fe (d ≈80 нМ) в дозировке 4 мг/кг и креатинин в дозировке 3 г/кг полнорационного комбикорма.

Скармливание корма в составе рациона для цыплят-бройлеров в течение периода выращивания обеспечивает повышение интенсивности роста цыплят на 2-3 г/сутки и снижение содержания жира в тушке до 4 %. При этом экономический эффект достигает 3,3 тыс. рублей на 1000 цыплят в ценах 2016 года. Показано, что предлагаемый корм для птицы может иметь большее продуктивное действие при сочетанном применении с аминокислотами: лизин и метионин.

5. Способ повышения продуктивности крупного рогатого скота реализуемый через использование вновь разработанной методики выявления, коррекции и профилактики элементозов. По результатам исследований подана заявка на получение патента РФ на изобретение.