Отчет за 2022

Проведенные исследования позволили выявить способность внеклеточных/клеточных продуктов микроорганизмов рода Bacillus, входящих в состав пробиотических препаратов (Bacillus cereus IP 5832(1), Bacillus cereus IP 5832(2) – компоненты «Бактисубтила» (Patheon France, Франция) двух разных партий, B. subtilis B-7092 и Bacillus clausii компоненты серии пробиотиков «ВЕТОМ» (НПФ «Исследовательский центр», Россия), Bacillus subtilis УКМ В-5020, входящий в состав препарата «Субалин» (ЗАО «Биофарма», Украина), Bacillus atrophaeus – штамм, не входящий в состав пробиотика, но способный продуцировать вещества белковой природы с антимикробным действием). к подавлению аутоиндукторов в тестах с использованием C. violaceum 026 и E. coli pAL 103. По результатам блока экспериментов по оценке продукции виолацеина при ингибировании чувства кворума внеклеточными продуктами микроорганизмов рода Bacillus можно говорить о высокой чувствительности кворум-зависимого биосинтеза виолацеина C. violaceum NCTC 13274 к действию внеклеточных ферментов. При этом наблюдается определенная временная зависимость: чем больше происходит инкубация внеклеточных ферментов тестируемых штаммов микроорганизмов рода Bacillus с C. violaceum NCTC 13274, тем выше ингибирующая активность. Сам механизм подобного проявления активности пока не понятен, и требует дальнейшего и более глубокого изучения, но можно предположить, что фермент накапливается в биомассе, с увеличением времени инкубации происходит ее автолиз и фермент выходит наружу, при этом скорость синтеза данных ферментов у штаммов бацилл различна, и возможно зависит от плотности популяции кворум-зависимых микроорганизмов. На основании этого предварительно можно расположить исследуемые микроорганизмы в следующем порядке по мере уменьшения кворум-ингибирующей активности внеклеточных ферментов в зависимости от времени инкубации: B. subtilis 5020, B. atrophaeus, B. cereus IP5832 (1), B. cereus IP5832 (2), B. clausii, B. subtilis B-7092.

По результатам блока экспериментов по оценке действия клеточных биомасс микроорганизмов рода Bacillus на продукции виолацеина также можно говорить о наличии ингибирующей активности тестируемых штаммов, при этом следует отметить, что по действию клеточных биомасс наблюдается как прямая, так и обратная временная зависимость. Активность B. cereus IP5832 (2) и B. subtilis 5020 увеличивается с течением времени, а B. cereus IP5832 (1), B. subtilis B-7092 и B. atrophaeus – снижается. Эффект увеличения активности бацилл с течением времени пока не понятен, и будет изучен в дальнейших исследованиях, а обратную зависимость можно объяснить тем, что тут имеет значение фаза роста культуры, максимальной эффект достигается при экспоненциальной фазе, что является логичным: увеличение числа клеток ведет к увеличению синтеза клеточных ферментов, а замедление происходит на стационарной фазе при условии уменьшения питательных веществ в среде и конкурентную борьбу за них с модельным штаммом. На основании полученных результатов предварительно можно расположить исследуемые микроорганизмы в следующем порядке по мере уменьшения кворум-ингибирующей активности клеточных биомасс в зависимости от времени инкубации: B. cereus IP5832 (1), B. cereus IP5832 (2), B. atrophaeus, B. subtilis 5020, B. subtilis B-7092, B. clausii.

При анализе взаимосвязи активности внеклеточных и внутриклеточных продуктов микроорганизмов рода Bacillus, выступающих в качестве ингибиторов чувства кворума были отмечены, как качественные, так и количественные различия в способности штаммов Bacillus sp. реализовывать деградацию или инактивацию ГСЛ, а также продемонстрирована синхронная направленность результатов, получаемых с помощью различных тест систем.

Отчет за 2022

В результате проведенных исследований были детально проанализированы штаммы родов Lactobacillus; проявивших максимальную активность в тестах на C. subtsugae 026 (C. violaceum 026). Согласно полученным результатам в рамках данной серии экспериментов, процесс кворум-зависимого биосинтеза виолацеина C. subtsugae 026 высоко чувствителен к воздействию клеточных ферментов бактерий рода Lactobacillus. По полученным данным изучаемые микроорганизмы возможно расположить в порядке усиления QS-ингибирующей активности их клеточных компонентов: L. acidophilus 13 ‹ L. plantarum ‹ L. casei ‹ L. acidophilus 20. Однако оценивая результаты действия клеточных ферментов представителей рода Lactobacillus на ингибирование можно отметить ярко выраженного действия в сравнении с представителями рода Bacillus выявлено не было.

Была исследована природа инактивирующего агента, в результате чего было выявлено, что активное вещество белковой природы. Было проведено предварительное фракционирование белков штаммов и были получены хроматограммы для супернатантов штаммов родов Bacillus, проявивших максимальную активность в тестах с использованием C. subtsugae 026 (C. violaceum NCTC 13274). Далее было проведена оценка физико-химических свойств супернатанта микроорганизмов B. subtilis ВКПМ 5020. По полученным данным был сделан вывод о неспецефическом ингибировании ГСЛ микроорагнизмами рода Bacillus, а гипотеза о гидрофобной природе связывания ГСЛ исключена. были созданы различные комбинации физико-химических факторов для обработки супернатантов, которые не показали увеличения антикворум эффекта при сочетанном действии.

Был проведен поиск генов, ответственных за инактивацию ГСЛ клеточной биомассой исследуемых микроорганизмов, проявивших максимальную активность в тестах с использованием C. subtsugae 026 . В результате секвенирования была обнаружена последовательность в 704 нуклеотида , которая имела 99 % сходство с геном aiiA, кодирующего лактоназу у микроорганизма штамма B. toyonensis BCT-7112. Было выявлено 99 % гомологии секвенированного участка с геном aiiA B. sp-546, 99 % ‒ c B. thuringiensis MC28, 90 % ‒ c B. cereus Y2. Кластерный анализ полученных данных показал, что выявленный ген не кластеризуется с известными генами B. cereus, а формирует новую ветку с B. toynensis. Таким образом в клеточной биомассе B. cereus обнаружен и идентифицированн ген aiiA (лактоназа), отличающийся от ранее известных генов B. cereus. Тем не менее клонирование данного гена в клетки XL1-Blue E. coli подтвердила его антикворум-активность.